Se realizaron estudios en el Centro de Genética Humana y Medicina de Laboratorio (Martinsried, Alemania) e IMGM Laboratories (Martinsried, Alemania) con el nueva sistema de sobremesa GS Junior de Roche (Basilea, Suiza).
El sistema GS Junior permite la secuenciación de muestras de una amplia variedad de materiales de partida, incluyendo ADN genómico y productos de la PCR. Las muestras, tales como ADN genómico se fragmentan aleatoriamente en pequeñas piezas de 300 a 800 pares de bases. Para muestras más pequeñas, como ARN pequeños no codificadores o amplicones de PCR, la fragmentación no es necesaria.
Usando una serie de técnicas estándar de biología molecular, se añaden adaptadores cortos de ADN a cada fragmento de la genoteca. Estos adaptadores se utilizan en los siguientes pasos de cuantificación, amplificación y secuenciación. La genoteca de ADN de cadena simple se inmoviliza sobre perlas de captura de ADN diseñadas específicamente. Cada perla lleva un único fragmento de la genoteca de ADN de cadena simple. La genoteca unida a las perlas se emulsiona con reactivos de amplificación en una mezcla de agua en aceite que produce microrreactores que contienen sólo una perla con un fragmento único de la genoteca de la muestra.
Cada fragmento único de la genoteca de la muestra se amplifica por clonación dentro de su microrreactor, excluyendo las secuencias competidoras o contaminantes. La amplificación de toda la colección de fragmentos se efectúa en paralelo; cada fragmento produce varios millones de copias del fragmento original por perla. Posteriormente, las emulsiones se rompen para facilitar la recogida de los fragmentos amplificados unidos a sus perlas específicas.
Los fragmentos amplificados clonalmente se enriquecen y se cargan en un dispositivo PicoTiterPlate para la secuenciación. El diámetro de los pozos del PicoTiterPlate permite sólo una perla por pozo. Después de la adición de enzimas y reactivos de secuenciación, el subsistema de fluidos del Sistema Genome Sequencer hace fluir nucleótidos en serie en un orden fijo (es decir, primero T, luego A y así sucesivamente) a través de los cientos de miles de pozos que contienen una perla cada uno. La adición de uno (o más) nucleótido(s) complementario a la cadena matriz produce una señal quimioluminiscente registrada por la cámara CCD del Sistema Genome Sequencer. La intensidad de la señal resultante es proporcional al número de bases incorporadas.
La combinación de intensidad de señal e información posicional generada en todo el dispositivo PicoTiterPlate permite al software determinar la secuencia de 100.000 lecturas individuales en cada ciclo de 10 horas del instrumento al mismo tiempo. Para el análisis de datos de secuenciación, se proveen tres diferentes herramientas bioinformáticas y que soportan fácilmente las aplicaciones siguientes: ensamblaje del genoma de novo hasta 3 Gb; resecuenciación/mapeo de genomas de cualquier tamaño y detección de la variante de amplicón por comparación con una secuencia de referencia conocida.
El sistema GS Junior pesa sólo 25 kg y mide 40 cm de ancho x 60 cm de profundidad x 40 cm de altura (aproximadamente el tamaño de una impresora láser). A pesar de este pequeño tamaño, el GS junior abarca todo el poder de la tecnología de secuenciación 454 de Roche.
“El futuro del tratamiento personalizado de tumores se encuentra en este método de secuenciación” dijo el Dr. Hanns-Georg Klein, director de IMGM y del Centro de Genética Humana y Medicina de Laboratorio. “Mediante nuestra investigación, hemos descubierto que es crítico asegurar un análisis exhaustivo de una población variante del tumor, incluyendo mutaciones conocidas y nuevas”.
Enlaces relacionados:
Center for Human Genetics and Laboratory Medicine
IMGM Laboratories
Roche
