Análisis rápido de flujo lateral detecta las variantes de la COVID-19 y diferencia la COVID-19 de otras enfermedades virales respiratorias

Paul, EUA) utilizaron la herramienta de edición de genes CRISPR/Cas9 para desarrollar dos pruebas rápidas de diagnóstico de flujo lateral. Los CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) son segmentos de ADN procariótico que contienen repeticiones cortas de secuencias de bases. A cada repetición le siguen segmentos cortos de “ADN espaciador” de exposiciones anteriores a un virus bacteriano o plásmido. Desde 2013 se ha utilizado el sistema CRISPR/Cas9 en la investigación para la edición de genes (agregar, interrumpir o cambiar la secuencia de genes específicos) y la regulación de genes. Al administrar la enzima Cas9 y los ARN guía apropiados (ARNsg) en una célula, el genoma del organismo se puede cortar en cualquier ubicación deseada. El sistema CRISPR/Cas9 convencional de Streptococcus pyogenes se compone de dos partes: la enzima Cas9, que escinde la molécula de ADN y guías específicas de ARN que llevan la proteína Cas9 al gen diana en una hebra de ADN.

Los investigadores integraron reactivos disponibles comercialmente en un ensayo de flujo lateral (LFA) basado en CRISPR/Cas9, que podría detectar secuencias del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) con especificidad de una sola base. Este enfoque requería un equipo mínimo y representaba una plataforma simplificada para la implementación en el campo. También desarrollaron un ensayo rápido múltiplex de escisión de nucleasa CRISPR/Cas9 de fluorescencia, capaz de detectar y diferenciar el SARS-CoV-2, la influenza A y B y el virus sincitial respiratorio (VSR) en una sola reacción.

Las tiras reactivas del LFA emplearon isotiocianato de fluoresceína (FITC)/6-carboxifluoresceína (FAM) y biotina unidas para generar un resultado positivo. Por lo tanto, los investigadores utilizaron un cebador de PCR marcado con FITC/FAM y un Cas9 biotinilado inactivo con nucleasa (“muerto”) y un solo ARNsg específico para el gen ORF8a del SARS-Co-V-2 para marcar los amplicones para su detección mediante el LFA. Este enfoque fue capaz de resolución de un solo nucleótido y evitó falsos positivos de dímero de cebador o artefactos de amplificación no específicos que podrían ocurrir con el uso de cebadores en tándem marcados con FITC y biotina para los LFA.

“La aprobación de la vacuna contra el SARS-CoV-2 es muy prometedora, pero el tiempo entre las primeras dosis y la inmunidad de la población puede ser de meses”, dijo el primer autor, el Dr. Mark J. Osborn, profesor asistente de pediatría en la Facultad de Medicina de la Universidad de Minnesota. “Esta plataforma de pruebas puede ayudar a cerrar la brecha entre la inmunización y la inmunidad”.

Las pruebas rápidas de LFA se describieron en la edición en línea del 12 de febrero de 2021 de la revista Bioengineering.

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Facultad de Medicina de la Universidad de Minnesota