Protocolo de análisis de secuenciación de próxima generación para el SARS-CoV-2 puede procesar decenas de miles de muestras en menos de 48 horas

Se han presentado varios métodos, algunos que detectan proteínas virales de hisopados nasofaríngeos (como las pruebas de antígenos) y otros que detectan la presencia de ARN viral a partir de hisopos, muestras de gárgaras o muestras de saliva (como las pruebas de transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa, o RT-PCR).

Aunque las pruebas de antígenos facilitan algunos aspectos logísticos de las pruebas masivas, su poder de detección es relativamente débil: los individuos infectados que portan cantidades bajas de virus permanecen sin ser detectados y pueden continuar infectando a otras personas. Las pruebas de PCR, por otro lado, son más sensibles porque multiplican fragmentos del genoma viral antes de escanear las muestras en busca del virus. Sin embargo, se basan en la detección de etiquetas fluorescentes que señalan secuencias virales, lo que significa que agrupar muestras procedentes de diferentes personas hace que el proceso sea bastante ineficaz: si un grupo da positivo, todas las muestras dentro del grupo deben ser analizadas individualmente de nuevo para identificar la fuente de la señal fluorescente. Se necesitan demasiadas máquinas, demasiado caras, demasiado lentas.

El nuevo método, desarrollado por científicos en el BioCenter de Viena, podría permitir que grandes grupos sean evaluados para el SARS-CoV-2 con la misma sensibilidad que las pruebas de PCR habituales. SARSeq, o “Análisis de saliva por secuenciación de ARN”, logra una alta sensibilidad, especificidad y el poder de procesar hasta 36.000 muestras en menos de 48 horas. El principio de prueba es conceptualmente simple: las muestras de pacientes individuales se recogen en los pozos de una placa de prueba, un pozo para cada muestra. Luego, un fragmento de ARN viral exclusivo del SARS-CoV-2, el gen de la nucleocápside, se convierte selectivamente en ADN y se amplifica por PCR en cualquier pozo que lo contenga.

Lo que diferencia este primer paso de la prueba de PCR habitual es que cada muestra recibe un conjunto único de secuencias de ADN cortas, o códigos de barras, que se adhieren al ADN viral amplificador. En un segundo paso de amplificación, todas las muestras de una placa se agrupan en un pozo, que recibe un segundo conjunto de códigos de barras de ADN únicos. El contenido de varias placas se puede combinar una vez más, ya que las moléculas de ADN de cada muestra llevan una combinación única de dos conjuntos de códigos de barras. Esta estrategia de agrupación y códigos de barras hace que SARSeq sea altamente específico y escalable. Además, el método basado en NGS permite probar varios ARN en paralelo, incluidos los ARN que controlan la calidad de la muestra o los ARN de otros patógenos para el diagnóstico diferencial.

El procedimiento de análisis se puede realizar en paralelo a los diagnósticos existentes, al tiempo que es independiente de los cuellos de botella en las cadenas de suministro. Por lo tanto, no compite con otros métodos de prueba para reactivos o equipos. Los principios detrás de SARSeq son simples y adaptables a cualquier patógeno respiratorio. A medida que la población mundial se dispara junto con nuestra proximidad a los animales, los métodos de diagnóstico de vanguardia como SARSeq serán cruciales para evitar que futuras enfermedades se propaguen como un incendio forestal.

“La amplificación del material viral de muestras individuales al máximo homogeneiza su cantidad en las muestras positivas, lo que hace que SARSeq sea altamente sensible”, explicó Luisa Cochella, líder de grupo en el Instituto de Investigación de Patología Molecular (IMP). “Dentro de las miles de muestras que pudimos analizar simultáneamente, algunas pueden contener hasta 10 millones de veces más partículas de coronavirus que otras; si reuniéramos esas muestras antes de la amplificación, aquellas con grandes cantidades de material viral podrían enmascarar otros casos positivos”.

“Combinamos la sensibilidad de la PCR con el alto rendimiento de la tecnología de secuenciación de próxima generación, o NGS, la misma que se utiliza para secuenciar el genoma humano. La máquina NGS procesa las muestras agrupadas y nos dice qué muestras contenían material de SARS-CoV-2. Los códigos de barras nos permiten distinguir cada muestra positiva de las demás y rastrearla hasta un paciente”, agregó Ramesh Yelagandula, primer autor del estudio.

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Vienna BioCenter